Пользовательский поиск

Микроспектрофотометрический и кариоцитометрический анализ

На первых этапах разработки методов фотометрии препара­тов для морфометрических целей измерения проводили «по точ­кам». A. Pollister, Н. Ris (1947) предложили фотометрировать всю клетку целиком, усредняя тем самым степень поглощения разных структурных образований. Однако неравномерность распределения вещества в клетке при измерениях указанными методами обусловливала большую погрешность. Совершенно новые перспективы открывает метод последовательной микроспектрофотометрии — сканирование. Для демонстрации и срав­нения разных методов абсорбционной цитофотометрии удобно обратиться к исследованию окрашенного клеточного ядра. При­ступая к оценке содержания ДНК в ядре, можно ставить перед собой самые разные цели, требующие измерений различной точ­ности. Если нужно выявить клетки, в которых происходит син­тез ДНК, или измерить умеренную анеуплоидию, то ошибка не должна превышать ±10%. Наконец, для того чтобы проверить гипотезу постоянства содержания ДНК или выявить ничтожную анеуплоидию требуется максимально возможная точность.

Продолжение ниже

Анализ крови на ВИЧ

Существует ряд анализов, используемых для определения того, инфицирован ли человек ВИЧ, вирусом, вызывающим СПИД. Это включает анализ крови на антитела ...

Читать дальше...

всё на эту тему


При приближенном подходе при цитофотометрии измеряют достаточно большое поле, куда попадают целое ядро и окружа­ющая его свободная площадь препарата. Образующаяся при этом комбинация светлого околоядерного пространства и тем­ного ядра обусловливает ошибки до 40%.

Более совершенным подходом к измерению ядра является млаг-метод, при котором фотометрируется малая площадь в центре ядра. Этим исключается заметная разница между фоном и ядром, а также значительно уменьшаются вариации оптиче­ской плотности, обусловленные структурой ядра. Ошибка рас­пределения при этом становится значительно меньше. Таким образом, локальное значение плотности определяется с большой точностью. Применение плаг-метода ограничивается сравнитель­но однородными объектами. В этих условиях получают резуль­таты с ошибкой не менее 10%. Измеряя указанным методом большое число участков в центральной части ядра, исследова­тель полностью использует преимущество малого размера зонда и исключает ошибку, связанную с гетерогенностью объекта. По­следняя разновидность плаг-метода состоит в систематическом измерении всех участков внутри анализируемого объекта.

Процесс сканирования дает возможность измерить мгновен­ные значения интенсивности пучка света, провести логарифми­рование и их суммирование. Используя пучок сравнения или повторное сканирование свободной от клеток площади препара­та, получают соответствующий интеграл для фона. Разность между этими двумя суммами представляет собой интеграл оп­тической плотности, который прямо связан с количеством хро­мофора на площади сканирования. Для того чтобы ошибка распределения исключалась полностью, линия сканирования должна захватывать такую часть клетки, размер которой не превышает оптического разрешения прибора. Метод дает хоро­шую воспроизводимость результатов, а систематическая ошиб­ка может быть доведена до нуля [Автандилов Г. Г., 1984].

При изучении окрашенных препаратов в видимой части спе­ктра определяют количество красителя, связанного с исследуемым веществом. В связи с этим перед фотометрированием следует установить, существует ли прямая пропорциональность между количеством красителя сорбированного исследуемым объектом и количеством вещества объекта. Если изменения этих показа­телей коррелируют между собой, то гистохимическая реакция является количественной и может быть использована микро-спектрофотометрия [Журавлева Т. Б., Прочуханов Р. Б., 1980]. При разработке количественных методик устанавливают, в пре­делах каких концентраций и толщин среза соблюдается закон Бугера — Ламберта — Беера.

Другими словами, между оптической плотностью, концент­рацией и толщиной слоя красителя, а также количеством иссле­дуемого вещества должна быть прямая пропорциональная за­висимость. Изменение светопоглощающих свойств красителя вследствие изменения его концентрации происходит в связи с изменением ионизации, полимеризации вещества и другими при­чинами, что трансформирует коэффициент поглощения, который должен по закону оставаться постоянным. Так, фиксирование биологического материала изменяет показатель его преломле­ния до 1,53—1,57. После окрашивания в срезе или мазке возни­кают две дополнительные причины световых потерь: специфи­ческое поглощение (позволяющее установить массу хромофоров в изучаемой структуре) и специфическое рассеяние, обусловлен­ное свойствами рефракции вещества красителя. Величина рас­сеяния зависит от величины и формы окрашенных структур и показателя преломления среды, в которую заключен объект ис­следования. Установлено, что если показатель преломления не­окрашенного препарата совпадает с показателем преломления среды, то среда почти полностью устраняет потери от специфи­ческого рассеяния.

При фотометрии физико-химически неоднородных срезов тка­ней и клеток очень важно добиться сохранения линейной зави­симости между фототоком и увеличением площади фотометрирования (без препарата). Микроспектрофотометрия проводится при свете с определенной длиной волны, обеспечивающей мак­симум поглощения хромофором. Если в серии однотипных изме­рений на двух различных длинах волн обнаружится одинаковое процентное содержание хромофоров, то типы их упаковок в исследованных объектах считают идентичными. Более подроб­ное описание отклонений от закона Бугера — Ламберта — Беера при микроспектрофотометрии дается в источниках, приведенных в списке литературы. Уменьшение объема клетки при фиксации изменяет концентрацию вещества, оставляя без существенных сдвигов его общее количество.

В качестве предпосылок к микроспектрофотометрическому анализу приводится ряд рекомендаций [Бродский В. Я., 1966].

  1. Исследуемое вещество должно полностью сохраняться в препарате в процессе подготовки.
  2. Поглощение лучей должно быть пропорциональным кон­центрации исследуемого вещества.
  3. Оптическая плотность хромофоров должна быть пропор­циональна количеству молекул исследуемого вещества.
  4. Абсорбционный спектр исследуемого вещества должен быть известен, а если изучается несколько поглощающих ком­понентов, то их абсорбционные свойства должны быть одина­ковыми.
  5. В пределах фотометрируемого участка оптические свой­ства фона (оптическая плотность и спектр поглощения) должны быть постоянными.
  6. С изменением длины волн неспецифические потери света, связанные со свойствами изучаемого вещества, не должны из­меняться.
  7. Стабильность работы всех приборов заслуживает специ­ального внимания.

Техника микроспектрофотометрического анализа и обработ­ка результатов наблюдения в общих чертах заключаются в сле­дующем.

После проверки стабильности работы прибора к зонду под­водят участок препарата, не занятый срезом (клеткой), и из­меряют интенсивность света, прошедшего через этот участок (интенсивность фона /0), затем регистрируют интенсивность света, прошедшего через изучаемый отдел клетки (/) или груп­пы клеток, и производят соответствующие вычисления для опре­деления оптической плотности изучаемого вещества (десятич­ный логарифм величины, обратной коэффициенту пропускания).

Микроспектрофотометрический анализ осуществляется фото­графическим и прямым методами. При фотографическом методе фотометрируется негатив объекта. Его почернение определяется по характеристической кривой, получаемой с помощью ступен­чатого ослабителя, снятого на ту же пластинку. Делают снимки структуры с веществом (почернение S) и той же структуры без вещества (почернение S0).

В заключение следует подчеркнуть, что в работе патологов на первый план выступает не определение абсолютного количе­ства вещества, а сравнительная (относительная) оценка содер­жания изучаемых веществ в условиях нормы и в разных фазах патологического процесса [Автандилов Г. Г., 1973, 1984]. В свя­зи с этим необходимо получить информацию от большого числа объектов, причем исследуемые срезы должны быть одинаковой толщины и обработаны в стандартных условиях. Для исследо­вания кусочки органов от подопытного и контрольного живот­ных или из нормального и патологически измененного отделов органа монтируются в один блок (замораживание или заливка в среду). Таким образом один срез или серию срезов с двух кусочков подвергают гистохимической обработке. Этот метод дает возможность исключить влияние неодинаковой толщины срезов, качества реактива и растворов, температурного режима и других неуточненных факторов, влияющих на ход гистохими­ческих реакций [Журавлева Т. Б. и др., 1978]. При невозможно­сти соблюдения указанных условий для микроспектрофотометрии отбирают срезы одинаковой толщины. При сравнительной микроспектрофотометрии количество вещества в клетке (Pi) можно выразить в произвольных единицах.

Параметры изучаемого морфологического объекта, имеюще­го непрерывный спектр значений (объем, площадь, концентра­ция и др.), требуют количественной оценки, но если количест­венная характеристика объекта представляет собой набор дис­кретных, существенно отличающихся друг от друга значений или имеются качественные переходы, то допустима балльная оценка. Иногда она становится единственно возможной. Опыт применения морфометрии в патологии позволяет считать более приемлемыми для практики относительные показатели. Индек­сы отношений между данными изменений объекта зависят от метода обработки ткани. Индексы, приводимые разными авто­рами, более сопоставимы, чем абсолютные характеристики. Указанный подход применяли в обосновании принципов и ме­тодов сравнительной микроспектрофотометрии [Автандилов Г. Г.].

С помощью избирательного сканирования с визуальным конт­ролем получены, например, данные о выборочном «гистоэнзиматическом профиле» нормальных и патологически измененных тканей и органов [Автандилов Г. Г., Круглова И. С., 1970, и др.].

Сравнительная микроспектрофотометрия отдельных зон мио­карда позволила выявить определенные закономерности в из­менении активности окислительных ферментов в различные сроки экспериментальной ишемии миокарда. Описан­ная цикличность изменения активности окислительных фермен­тов может демонстрировать весьма важную общепатологическую закономерность [Автандилов Г. Г. и др., 1972]: фермент­ные системы компенсируют нарушенный обмен в клетке согла­сованными ритмическими изменениями синтеза и активности ферментов по определенным фазам с различной амплитудой. Для ферментных систем, как мы полагаем, характерна биокибернетическая регуляция, в результате которой любые отклоне­ния от нормального уровня (гистоэнзиматического гомеостаза) стимулируют компенсацию, возвращающую метаболическую систему к исходному уровню функционирования. Длительно дей­ствующая и нарастающая циркуляторная гипоксия тканей при­водит к патологии ферментного гомеостаза: своеобразной для каждого органа картиной в изменении периодов и амплитуд реакций и угасанию активности отдельных ферментов при нарастании гипоксии. Данные о динамике гистоэнзимологии мио­карда, имеющего своеобразные ритмы, фазы и амплитуды из­менения активности ферментов, могут быть учтены при диффе­ренцированной по срокам и дозировкам метаболической защите (ферментотерапии) органов при ишемических повреждениях [Автандилов Г. Г. и др., 1971], а также привлечены для обосно­вания теории фазности динамики гистоэнзимопатий.

С теоретической и практической точек зрения наиболее ин­тересно развитие цитофотометрического анализа процессов малигнизации тканей.

Исследования гистологических препаратов ограничиваются срезом клеток и ядер на разных уровнях, что отражается на результатах измерения толщины среза и ориентировки клеточ­ных элементов. Микроспектрофотометрическое исследование гистологических срезов требует учета этих ограничений и со­ответствующей статистической коррекции получаемой инфор­мации.

Измерение содержания ДНК в ядре в срезе упрощается при применении сканирующей интегрирующей кадровой микроспек­трофотометрии [Автандилов Г. Г., 1980] с подбором оптималь­ной толщины и ориентировки гистологического среза. С целью объективизации диагностики и прогнозирования предопухолевых процессов и новообразований мы использовали кадровую микроспектрофотометрию окрашенных по Фельгену ядер клеток рост­ковых зон эпителия и опухолей (в срезах одинаковой толщины). «Индекс накопления ДНК» — ИНДНК (взвешенное среднее арифметическое содержание ДНК на ядро) для нормального эпителия исследованных органов не превышал 2,3—2,8 единицы плоидности (с). В доброкачественных опухолях и при простых гиперпластических и диспластических процессах ИНДНК до­стигал 3,6 с. Пограничным, переходным состояниям ткани с мор­фологическими признаками пролиферации и атипической гипер­плазии (тяжелой дисплазии) были присущи более высокие показатели: 4,9—6,5 с, т. е. наблюдалось удвоение исходного показателя нормальной ткани. Все злокачественные новообра­зования эпителиального генеза, внутриэпителиальные и инва­зивные карциномы, как и аденокарциномы, отличались значи­тельно более высокими значениями ИНДНК — 9,6—10,8 с на ядро росткового слоя. Указанная закономерность получила практическое подтверждение при дифференциальной диагности­ке дисплазии эпителия различных степеней [Агамова К. А. и др., 1987].

В многочисленных публикациях детально описываются ультраструктурные основы строения клеточных и тканевых элемен­тов, их изменения в условиях патологии. Однако накопленная информация об ультраструктурной организации клеток, их спе­цифических и стереотипных реакциях, патологических измене­ниях нуждается в систематизации и переоценке с позиций до­стоверности и воспроизводимости каждого факта, определения выраженности изменений ультраструктур в условиях патологии.

Методы системного стереологического анализа клеток на всех уровнях, включая электронно-микроскопический, дают воз­можность более достоверно оценить характер и выраженность патологических изменений. Стереологические методы позволяют создавать математические модели, описывающие изменения внутриклеточных структур в условиях различных воздействий и развития патологического процесса [Невзоров В. П., 1978; Автандилов Г. Г. и др., 1984; Mayhew Y., White F., 1980; Pfei­fer U., 1980; Weibel E., Taylor C., 1981]. Поля зрения выбирают по схеме, показанной на рис. 64.

Известно, что увеличение электронного микроскопа равно произведению увеличений всех его линз, зависящих от стабиль­ности тока питания. Отсюда следует, что погрешность в опре­делении увеличения слагается в основном из погрешности опре­деления тока промежуточной линзы, погрешности определения увеличения по графику, прилагаемому заводом — изготовителем прибора, нестабильности токов линз и ряда других причин. По­скольку питание всех линз электронного микроскопа осуществ­ляется высокостабилизированными источниками тока, основную погрешность вносят измерительный прибор, показывающий ток промежуточной линзы, и график зависимости увеличения от то­ка промежуточной линзы.

Например, если используется реплика с решетки п = = 1200 лин/мм и при этом расстояние между линиями на фото­пластинке составляет 10 мм, то истинное увеличение микроско­па М= 1200-10= 12 ООО.

При дальнейшей работе с таблицей следует учитывать, что воспроизводимость увеличения достигается при переходе от низ­кого увеличения к более высокому. При переходе от более вы­сокого увеличения к низкому надо переключателем тока проме­жуточной линзы установить более низкое увеличение, чем необ­ходимо для исследования, и после этого поднять увеличение до желаемого. При съемке реплик необходимо хорошо отъюстиро­вать микроскоп и записать значение токов всех линз (исключая промежуточную и объективную, значения которых меняются в процессе работы), а при последующих настройках устанавли­вать именно эти значения, поскольку изменения токов линз влекут за собой небольшое изменение увеличения.

Если стереометрия проводится по микрофотографиям, то не­обходимо учитывать дополнительное увеличение, обеспечивае­мое фотоувеличителем. При использовании электронных микро­фотографий фотографическое увеличение вычисляют следую­щим образом: на прозрачную стеклянную фотопластинку тушью наносят отрезок длиной 1 см. Затем пластинку вставляют в фо­тоувеличитель и проецируют на экран при выбранном для изго­товления микрофотографии увеличении. Линейкой измеряют длину проекции линии и вычисляют величину увеличения фото­увеличителя как отношение длины спроецированного отрезка к его истинной длине. Для получения конечного увеличения на микрофотографии надо электронно-оптическое увеличение мик­роскопа умножить на увеличение фотографическое.

При подготовке препаратов для морфометрического анализа на ультраструктурном уровне следует иметь в виду, что в зави­симости от целей и задач могут использоваться различные уве­личения. Если анализу подвергается множество цитоплазмати­ческих включений и органелл в целом, то предпочтительно использование малого увеличения — 2000—3000. Исследование при таком увеличении требует более толстых срезов (70—90 нм), так как более тонкие срезы не создадут достаточного контраста. Выполнение такого анализа возможно при работе без проекционного наконечника и, как правило, без апертурной диафрагмы. В результате сильно снижаются контрастность изо­бражения и разрешающая способность микроскопа. Чтобы из­бежать уменьшения контрастности и разрешения микроскопа, следует работать с апертурной диафрагмой, но ее необходимо сделать достаточно большой, чтобы исключить перекрывание ею поля зрения. Диафрагма диаметром 100 мкм практически удовлетворяет этим требованиям. Анализ более мелких струк­турных компонентов клеток не вызывает особых затруднений, так как необходимые увеличения составляют 10 000—15 000 и более.

В практике электронно-микроскопических исследований для визуального наблюдения за изображением на экране с целью повышения точности наводки на резкость используется биноку­лярная лупа, вмонтированная в электронный микроскоп. Она позволяет рассматривать изображение препарата на экране с дополнительным увеличением. Лупу можно применять для стереологического анализа, выполняемого на электронном микро­скопе. Для этого необходимо иметь набор окулярных вставок с изображением различных тест-систем. Стереологический ана­лиз можно производить непосредственно на экране электронного микроскопа с помощью различных окулярных вставок, вмонти­рованных в бинокулярную лупу. Используют окуляр-микрометр с линейной горизонтальной шкалой, содержащей 100 делений. Цену деления определяют так: укрепив линейку с миллиметро­выми делениями на экране электронного микроскопа и совмес­тив ее с делениями окулярной вставки, определяют число деле­ний п окулярной вставки, которые укладываются в N делений миллиметровой линейки, укрепленной на экране.

Все окулярные вставки обладают одним недостатком — ли­нии на них имеют конечную толщину. В силу этого при анализе ультраструктур, размеры которых соизмеримы с толщиной тест-линий, возникает дополнительная ошибка, и число точек и от­резков, приходящихся на исследуемые структуры, всегда ока­зывается больше реального. Эта систематическая ошибка в некоторых случаях может достигать существенной величины.

Так как реальная точка в отличие от геометрической обла­дает конечными размерами, то чем больше B/d (ширина секу­щей линии В, диаметр пересекающих структур d), тем выше становится погрешность. Экспериментально показано, что при B/d = 0,25 результат почти вдвое превышает истинное значение. Этой ошибкой можно пренебречь, если отношение B/d<0,05.

Зная число структурных компонентов на единице площади среза, их средний размер и ширину линий, можно рассчитать поправочные коэффициенты, устраняющие систематическую ошибку, которая вызвана реальными размерами точек и линий окулярной вставки. Однако значительно проще избавиться от этой ошибки, подобрав окулярные вставки без такого недостат­ка. Если применить окулярные вставки, в которых используется граница между темными и прозрачными полями, то линии раз­дела не будут иметь реальной толщины.

Этим окулярные вставки позволяют проанализировать струк­туры, обладающие очень малыми линейными размерами.

В гистологической практике получили распространение окулярные вставки в виде регулярной решетки — набора точек [Автандилов Г. Г., 1972], а также многоцелевая тест-система [Weibel Е. et al., 1964], которая сочетает поля, точки и линии. Система содержит 21 линию и 42 точки, что позволяет исполь­зовать ее для определения объемных соотношений методом то­чечного счета (см. рис. 15). Кроме того, система позволяет вы­полнять и планиметрическое исследование, так как значение площади каждой контрольной точки равно 0,866 Z2 (см. фор­мулу 216).

Подсчитывая количество пересечений тест-линий с контура­ми объектов на срезе, определяют поверхностные характе­ристики.

Для работы на электронном микроскопе желательно иметь систему, состоящую из контрольных точек и линий. Линии име­ют контрольную систему с Рг=Ю0, которая весьма удобна, так как дает непосредственно процентное значение для объема ультра структуры. Контрольное поле является прямоугольником с горизонтальным значением 10Z и вертикальной стороной, рав­ной 5"|/3 Z=8,7Z. Е. Weibel, В. Knight (1964) использова­ли контрольную систему, вгравированную во флюоресцирующий экран электронного микроскопа, систему, вводимую в колонку микроскопа [Автандилов Г. Г. и др., 1984]. Эти приспособления позволяли получать необходимые измерения во время исследо­вания среза и экономить материалы и время.

Можно также регистрировать электронограммы на 35-мил­лиметровой пленке и оценивать контактные отпечатки с нега­тивов на проекционном столе. Эта процедура более эффективна и экономична. В зависимости от числа требуемых электронограмм отсчет можно начинать с произвольного поля и продол­жать исследование, пока не будет учтен размер образца. Заре­гистрированные поля могут быть определены и посредством случайных цифр. Первая процедура предпочтительнее. Поля, выбранные одним из этих методов, фотографируют на пленку. В конце каждого регистрируемого периода контрольный обра­зец (углеродная решетка) микрофотографируют для целей ка­либровки.

Для работы с позитивами электронных фотографий исполь­зуют настольный проектор (можно применять аппарат для чте­ния микрофильмов). Экран состоит из полупрозрачной ацетат­ной бумаги с указанной многоцелевой контрольной системой, нарисованной тушью (вставляется между двумя стеклянными пластинками). Это дает возможность легко изменить контроль­ные системы соответственно требованиям работы. Выбор той или иной тест-системы принципиального значения не имеет. Во всех случаях точки должны быть равномерно распределены по площади среза. Этому правилу наиболее полно отвечает шести­угольная система. Следует отметить, что точность анализа оп­ределяется не числом точек, подсчитанных в одном поле зрения, а числом проанализированных полей зрения. Всегда предпочти­тельнее анализировать большее число полей зрения с меньшим: числом точек на каждом поле, чем добиваться увеличения об­щего числа точек путем применения на одном поле зрения тест-системы с большим количеством точек.

Для планиметрического анализа площади различных струк­турных компонентов и включений, имеющих форму, близкую к сферической, весьма полезной может оказаться окулярная встав­ка С. А. Салтыкова (1970). Площади черных кружков вставки в условных единицах (при необходимости их можно перевести в абсолютные величины) составляют от 1 до 50. Вся площадь, квадрата, внутри которого производится подсчет, выраженная в тех же единицах, равна 4800.

Планиметрию производят также с помощью вставок Г. Г. Ав­тандилова (1972), предварительно определив площадь, прихо­дящуюся на тест-точку. Определение линейно-поверхностных характеристик (абсолютные поверхности мембран, протяжен­ность волокнистых структур и др.) связано с подсчетом числа пересечений тест-системы с измеряемыми контурами. Для этих, целей можно применять все окулярные вставки. Если на гисто­логических препаратах присутствуют полностью или частично ориентированные комплексы структур, т. е. нарушается правило случайного распределения структурных компонентов, лучше применять тест-систему, состоящую из концентрически распо­ложенных окружностей [Невзоров В. П., 1978].

Использование метода линейного интегрирования основано на вычислении длины отрезков тест-системы, отсекаемых кон­турами изучаемых структур. Этот анализ по микрофотографиям не требует особых инструментов и может быть выполнен с по­мощью обычной линейки и измерителя. Если морфометрия про­водится визуально, непосредственно под микроскопом, то вы­числения выполняются различными способами. Эти операции могут производиться с помощью разных тест-систем, размеры которых заранее определены, т. е. известны цена делений лине­ек для каждой ступени увеличения электронного микроскопа, шаг решетки, расстояние между точками и т. д.

Отечественной промышленностью выпускается интегрирую­щий столик типа ИСА. Соединив его с ручкой перемещения препарата электронного микроскопа, можно одновременно оп­ределить содержание на срезе 6 элементов микроструктур, чего достаточно для большинства патоморфологических задач. Сто­лик имеет 6 головок, каждая из которых перемещает объект независимо от других. Величина перемещения регистрируется с помощью делений, нанесенных на каждую головку. Цену де­ления определяют описанным выше способом. Анализ внутри­клеточных структур может производиться с помощью любой из приведенных выше тест-систем, которые наносятся тонкой иглой на люминесцентный экран. Необходимо отметить, что данный способ морфометрического исследования не является наилучшим по следующим соображениям: во-первых, нельзя быстро менять тест-систему, так как это связано с заменой эк­рана в целом; во-вторых, визуальные наблюдения за качествен­ными изменениями биологических объектов будут затруднены постоянным присутствием сетки на экране, что быстро утомляет зрение исследователя. Целесообразнее в бинокулярный микро­скоп, служащий для детального изучения изображения на лю­минесцентном экране, помещать различные окулярные вставки. Следует только не забывать вводить поправку на увеличение.

Выполнение морфометрии на экране электронного микроско­па связано со сравнительно быстрым «выгоранием» среза под пучком электронов. В силу этого при необходимости документи­рования наблюдаемых картин надо сначала сфотографировать интересующие участки среза, а затем приступить к стереомет­рическому исследованию на экране микроскопа.

Стереологический анализ может проводиться с фотопласти­нок. Он достигается путем непосредственного наложения тест-систем на фотопластинки с подсветкой снизу либо с помощью, проекционных аппаратов. При этом возникают помехи — вос­приятие негативного изображения, но при навыке исследователя этот недостаток перестает ощущаться. Любой проекционный аппарат существенно облегчает подсчет, так как он возможен непосредственно на экране с необходимой тест-системой. Ука­занный способ счета достаточно продуктивен и экономически выгоден — не нужно изготавливать много фотографий.

Стереометрическое исследование связано с подсчетом точек, отрезков, точек пересечения микроструктур с секущей линией, точек квадратно-сетчатого окуляра, попадающей на исследуе­мые элементы структуры, и т. д. Для облегчения работы и ис­ключения ошибок, связанных со счетом, желательно использо­вать различные механические, электромеханические или элек­тронные счетчики. Простейший из них — 11-канальный счетчик, применяемый в гематологии для счета клеток крови. Если ана­лиз ведется по микрофотографиям, то можно использовать ап­парат для счета бактериальных колоний с электромеханическим счетчиком.

При изучении групповых количественных морфологических признаков наибольшее теоретическое и практическое значение имеют средние величины и их атрибуты, поскольку они могут характеризовать общие закономерности развития патологиче­ского процесса.

Подчеркнем, что абсолютную статистическую ошибку изме­рения стереометрической величины (при нескольких изме­рениях) получают как разность между истинной средней вели­чиной измеряемого элемента и полученной средней арифмети­ческой выборки.

Таким образом, для соблюдения этих условий необходимо про­анализировать 1236 ультраструктур. Учитывая, что на одной мик­рофотографии в приведенном примере с данным увеличением число митохондрий в среднем равно 30, для соблюдения постав­ленных условий необходимое число микрофотографий опреде­лим как 1235:30 = 41. Следовательно, подвергнув анализу 40— 50 микрофотографий, можно получить достаточно надежные результаты. Подсчет на нескольких препаратах позволит зара­нее приблизительно оценить объем работы для достижения за­данного уровня достоверности. Такая оценка полезна и в плане выбора стереологического метода, так как число микрофотогра­фий, которые нужно подвергнуть анализу, находится в зависи­мости от объемной доли изучаемых структур и от метода, с по­мощью которого проводится анализ. Дальнейшим развитием планиметрического метода является линейный метод [Rosiwal А., 1892], позволяющий производить измерение на срезе площадей исследуемых структур. Метод до­пускает замену определения объемов структур измерением не только площадей, как это было показано выше, но и длин от­резков тест-линий, отсекаемых контурами исследуемых компо­нентов клеток.

Видимая под микроскопом или на микрофотографии микро­структура любой конфигурации пересекается прямой линией или рядом параллельных линий. Контуры сечений внутрикле­точных структурных элементов на срезе ткани рассекают эти линии на отдельные отрезки. Если раздельно измерить суммар­ную длину отрезков Li, попадающих на каждый класс исследуе­мых структур, и разделить эту сумму на общую длину секущих линий L, то получаемые частные будут равны долям площади среза или объема, которые занимает каждая структурная со­ставляющая на единице площади или в единице объема.

Точность анализа будет тем выше, чем большую длину име­ют секущие линии, проведенные на срезе или его микрофото­графии [Loud A. et al., 1965, 1968], т. е. точность анализа опре­деляется суммарной длиной измеряемых в процессе анализа отрезков. Анализ можно производить по микрофотографиям или непосредственно под микроскопом, принципиального раз­личия нет. Если анализ проводится по микрофотографиям, то на них накладывают прозрачную тест-систему или линейку и по ней ведут подсчет. Для выполнения анализа под микроско­пом предпочтительно пользоваться окулярной вставкой, на ко­торую нанесена линейка, и подсчитывать длину отсекаемых отрезков в делениях. Повторяя такие измерения в различных полях зрения, получим среднестатистическую величину, доста­точно точно характеризующую классы анализируемых структур. Чем больше полей зрения проанализировано, тем точнее ре­зультат.

Например, необходимо провести анализ методом линейного интегрирования микрофотографии участка цитоплазмы гепатоцита печени крысы. Накладывая на микрофотографию 4 линейки из окулярной вставки и зная увеличение микрофото­графии, определяем абсолютные размеры тест-системы: длина 4 линеек L = 25 мкм; цена 1 деления (дел.) линейки л = 0,06мкм.

Так объемный состав ультраструктур цитоплазмы клеток и тканей вычисляется методом линейного интегрирования.

Естественно, на других микрофотографиях эти показатели будут отличаться, но среднестатистические величины при боль­шом числе проанализированных микрофотографий объективно охарактеризуют количественное содержание ультраструктур в исследуемых клетках.

При проведении анализа методом линейного интегрирования удобен специальный интегрирующий столик, который соединен с ручками перемещения предметного столика электронного мик­роскопа. Поместив в окуляр бинокулярной лупы вставку с пе­рекрестием, передвигаем препарат в поле зрения в горизонталь­ном направлении и перекрестием отмечаем пересечения различ­ных структур. Поскольку необходимо измерить длину переме­щения среза относительно перекрестия при его прохождении по различным структурам ткани и клеток, перемещение препарата через участки, занятые исследуемыми классами ультраструктур, осуществляют различными микровинтами. Метод линейного ин­тегрирования прост и менее трудоемок, чем планиметрические методы анализа. Его следует применять тогда, когда измеряе­мые ультраструктурные компоненты занимают более 5% объема ткани. Разрешающая способность метода, или его точность, за­висит от числа полученных и измеренных в процессе анализа отрезков, а число отрезков — от увеличения микроскопа и дис­персности анализируемых структур. Увеличение числа отрезков за счет малого увеличения нецелесообразно, так как снижается точность измерения длины отдельных отрезков. Рациональнее при большем увеличении проанализировать большее число по­лей зрения, равномерно распределенных по всей площади среза. Следовательно, точность анализа методом линейного интегриро­вания можно повысить увеличением числа анализируемых полей зрения или числа микрофотографий. Следует отметить, что точ­ность линейного метода зависит не только от числа проанали­зированных микрофотографий и суммарной длины тест-линий, но и от числа полученных и измеренных в процессе анализа отрезков.

Использование этих формул правомерно тогда, когда тест-система состоит из линий, равномерно покрывающих всю пло­щадь микрофотографии или поля зрения. В случае неориенти­рованных структур, т. е. изотропных систем, коэффициент К может быть принят равным 0,65. Если структуры имеют опре­деленную ориентацию (например, миофибриллы), то коэффи­циент К следует брать равным 0,35—0,4. При этом линии тест-системы предпочтительно располагать перпендикулярно ориен­тации структур.

Например, следует произвести объемный анализ изометриче­ски расположенных ультраструктур печеночных клеток по элек­тронным микрофотографиям и определить необходи­мое число полей зрения для достижения заданной вероятности безошибочного суждения Р = 0,95.

Зная электронно-оптическое и фотографическое увеличения, вычисляем цену деления линейки, наложенной на плоскость среза, и общую площадь среза. Электронно-оптическое увели­чение составляет 5500-1,3 = 7150. Следовательно, длина одной линии равна 15,4 мкм (цена одного деления — 0,154 мкм), об­щая длина тест-линии L= 15,4-8= 123,2 мкм.




© Авторы и рецензенты: редакционный коллектив оздоровительного портала "На здоровье!". Все права защищены.


 
Текст сообщения*
Защита от автоматических сообщений
Загрузить изображение
 

nazdor.ru
На здоровье!
Беременность | Лечение | Энциклопедия | Статьи | Врачи и клиники | Сообщество


О проектеКарта сайта β На здоровье! © 2008—2015
nazdor.ru, nazdor.com
Контакты Наш устав

Рекомендации и мнения, опубликованные на сайте, являются справочными или популярными и предоставляются широкому кругу читателей для обсуждения. Указанная информация не заменяет квалифицированную медицинскую помощь, основанную на истории болезни и результатах диагностики. Обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Размещенные на сайте информационные материалы, включая статьи, могут содержать информацию, предназначенную для пользователей старше 18 лет согласно Федеральному закону №436-ФЗ от 29.12.2010 года "О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию".