Статистическое обеспечение стереометрических исследований

Стереометрия широко использует статистические методы, так как результаты статистической обработки материала являются исходной информацией для объемной реконструкции плоскост­ных изображений. Это связано с тем, что исследователь не может провести замеры всей совокупности элементов анализи­руемой гистоструктуры и обычно довольствуется выборкой, т. е. измерением небольшого числа элементов объема ткани. Полу­чаемый выборочный материал в последующем переносится на всю структуру в целом согласно законам распределения слу­чайной величины. Кроме того, многие стереометрические мето­ды основаны на принципах теории вероятностей и математиче­ской статистики.

В настоящем разделе кратко излагаются описанные выше методы математической статистики, адаптированные для сте­реометрического анализа. Кроме хорошо известных методов ва­риационной и альтернативной статистики, описываются способы изучения усеченного распределения и некоторые непараметриче­ские критерии. Последние можно использовать и при изучении качественных признаков, заданных в шкале балльных оценок.

Поведение случайной (мерной) величины или, другими сло­вами, описание совокупности свойств всех структурных элемен­тов ткани из одной генеральной совокупности можно охаракте­ризовать с помощью вариационной статистики такими парамет­рами, как средняя арифметическая и ее дисперсия. При этом дисперсию часто заменяют средним квадратическим отклоне­нием (корень квадратный из дисперсии). Средняя арифметиче­ская дает среднюю величину данного типа структурных элемен­тов ткани, а дисперсия или среднее квадратическое отклонение показывает, насколько размеры каждого конкретного элемента могут отличаться от среднего значения [Автандилов Г. Г., 1973, 1980; Шорников Б. С., 1979; Автандилов Г. Г. и др., 1984; Не­помнящих Л. М. и др., 1984],

В связи с тем, что обычно изучается не вся генеральная со­вокупность элементов ткани, а только их небольшая выборка, нужно знать, насколько установленные выборочные статистики отличаются от статистик генеральной совокупности, т. е. всего изучаемого органа, системы. Этим целям служит, как известно, определение ошибки средней арифметической, которая показы­вает, насколько выборочная средняя может отличаться от сред­ней генеральной совокупности при выбранном уровне безоши­бочного суждения (3 порога надежности — 95; 97,5; 99,9%). В медико-биологических исследованиях 95% уровень значимости обычно считают достаточным для принятия гипотезы о пред­ставительности выборочных данных генеральной совокупности.

Обычно полагают, что среднее арифметическое с удвоенной сигмой заключает в себе 95% всех признаков морфологических элементов изученной выборочной совокупности. Фактически при нормальном распределении случайных величин средняя арифме­тическая и среднее квадратическое отклонение дают исчерпы­вающую информацию о распределении всех элементов изучен­ной выборочной совокупности. Однако морфолог не всегда встречается с нормальным законом распределения, что связано, с одной стороны, с трудностями получения истинно репрезента­тивной выборочной совокупности для данной генеральной сово­купности, а с другой — с тем, что при создании группы однород­ных явлений в выборке из данной генеральной совокупности могут встречаться отдельные элементы, принадлежащие другой генеральной совокупности. Например, при изучении какого-либо патологического процесса в простейшем случае морфолог может всю совокупность данного рода клеточных элементов разделить на две и более генеральных совокупностей: клетки с нормаль­ной морфологией и клетки с патологическими изменениями (с признаками дистрофии и т. д.). На данном уровне исследо­вания с учетом предела его разрешающей способности встре­тятся клетки в пограничных состояниях, которые без дополни­тельной информации могут быть отнесены как к одному, так и к другому подмножеству. В связи с этим полученные из них выборки могут содержать элементы другой генеральной сово­купности. Это, естественно, отразится на распределении случайной величины. Оценка изменения закона распределения случай­ной величины дает возможность диагностировать изменения в структурах, которые обычными описательными методами на данных стадиях процесса не улавливаются. Таким образом, пер­вичный статистический анализ еще без стереометрической обра­ботки позволяет выявить существующие изменения и оказывает­ся полезным в изучении разнообразия патологических про­цессов.

Проверка на нормальность закона распределения изучаемой случайной величины может быть проведена на основе коэффи­циентов асимметрии и эксцесса, которые соответственно нахо­дят по формулам.

Как отмечено выше, все параметры распределения случай­ной величины, полученные для выборочной совокупности, отра­жают только эту выборочную совокупность и поэтому не могут быть распространены на всю генеральную совокупность элемен­тов, если не установлено, что выборочная совокупность пред­ставительна для генеральной совокупности. Эта задача обычно решается с использованием ошибки средней арифметической, определяемой по формуле.

Таким образом, уже после первичной ста­тистической обработки материала без стереометрического ана­лиза могут быть решены вопросы о существенности изменений в размерах тех или иных изучаемых структур при патологиче­ском процессе данного типа. Заметим, что при & = 30 и более табл всегда равно 1,96, или 95% интервала достоверности (при­нятого в медико-биологических исследованиях), а в стереомет­рических разработках k всегда должно превышать 30 и поэтому нет необходимости использовать таблицу Стьюдента. Ниже по­казано, что данная задача (определение принадлежности выбо­рочных совокупностей одной или разным генеральным совокуп­ностям) может быть решена еще проще на основе использова­ния одного из критериев непараметрической статистики, когда вообще нет необходимости в расчете статистик распределения элементов в выборочных совокупностях.

Когда различий между выборочными статистиками опреде­лить не удается и их относят к одной генеральной совокупности, полезно найти межвыборочные (межгрупповые) параметры рас­пределения элементов данной генеральной совокупности, к ко­торым относят межгрупповые среднюю арифметическую, дис­персию, среднее квадратическое отклонение и ошибку средней арифметической. Они могут быть найдены следующим образом: межгрупповая средняя арифметическая.

Оценка межгрупповых статистик является важным элемен­том стереометрического анализа. Обычно при стереометрических исследованиях на гистологических срезах используют препара­ты, взятые из разных участков органа. Очевидно, что измеряе­мые в них структурные элементы могут относиться как к одной, так и к разным генеральным совокупностям. В норме это связа­но с регионарными особенностями строения данных структурно­-функциональных элементов органа, при патологии — с разной: выраженностью патологоанатомических изменений в различных его отделах. Для разных гистологических препаратов рекомен­дуется вычислять свои статистики (т. е. все элементы на данном гистологическом срезе принимают за одну выборку), после чего проводят проверку на их принадлежность одной генеральной совокупности. Только после того как статистический анализ показал, что по данному параметру разные срезы относятся: к одной генеральной совокупности, возможно объединение ре­зультатов замеров на разных объектах в одну межгрупповую совокупность с расчетом соответствующих параметров распреде­ления.

Описанный метод статистической обработки результатов из­мерений на микропрепаратах используют тогда, когда удается получить представительную случайную выборку из генеральной совокупности. Между тем в практической работе патоморфолога выборочная совокупность иногда оказывается односторонне «усеченной». В таком случае обычно методы статистического исследования не могут быть использованы.

Оказывается, что если известна точка усечения выборочного распределения, то ее статистики можно определить на основе нормального усеченного распределения. Под точкой усечения понимают ту величину Z из выборочной совокупности, далее которой замеры не проводились [Янко Я., 1961]. В практиче­ской работе могут встречаться усеченные распределения, но ис­следователь и сам может специально усечь распределение с целью не проводить замеры малых структур, дающих большую относительную погрешность измерений, и уменьшить число про­водимых замеров. Метод применим и тогда, когда по какой-либо причине ряд элементов данной структурной составляющей: препарата не выявляется и не может быть измерен.

Метод обработки материала по усеченному нормальному распределению при использовании ЭВМ не трудоемок и может быть рекомендован как метод выбора при обычной статистиче­ской обработке, когда можно получить полноценную выбороч­ную совокупность, и как необходимый метод при получении усе­ченных распределений. Заметим, что данный метод, несмотря на перспективность, пока не получил распространения в морфо­логических лабораториях.

Кроме методов вариационной статистики, при проведении стереометрического анализа мерных величин можно использо­вать методы альтернативной статистики. Сущность метода аль­тернативной статистики, изучающей случайные события, состоит в следующем. Если рассматривается какое-либо событие, имею­щее А равновероятных или разновероятных исключающих друг друга исходов, то вероятность появления любого из них можно оценить. При этом вероятность появления данного исхода есть отношение Р.

При проведении стереометрического анализа методы альтер­нативной статистики имеют большое значение.

Для оценки долевого вклада структурного элемента ткани органа в объем данной ткани или органа в целом используют­ся и планиметрические методы. В частном случае для этих це­лей применяют метод «полей», когда структурные составляющие ткани случайно совмещаются с точками тестовой решетки. При этом полагают, что между общей величиной ткани и величиной ее структурных составляющих и между общим числом точек решетки и числом точек, пришедшихся на данные структурные составляющие ткани, устанавливается определенное соответст­вие. Это позволяет по общему числу точек, пришедшихся на ор­ган (срез органа) в целом, и числу точек, пришедшихся на дан­ный вид ткани, оценить долевую часть (долевой вклад) данной ткани в объекте. При наложении такой решетки на орган для каждой точки возможны два исхода, которые могут быть как равновероятными, так и разновероятными: точка может совпасть с изучаемой структурой или может совместиться с другими ком­понентами ткани, не учитываемыми в исследовании. Следова­тельно, один подсчет числа точек, приходящихся на данную структурную составляющую ткани, с определением общего чис­ла точек, соответствующих всему образцу, и установлением доли данной структурной составляющей является недостаточным. При таком подходе у нас нет уверенности в том, что при по­вторных испытаниях (повторном наложении решетки и повтор­ном проведении подсчетов) результаты будут воспроизведены. Как и при вариационно-статистическом анализе, возникает не­обходимость не только оценить долевой вклад данной структур­ной составляющей в объект, но и установить возможные коле­бания показателей с оценкой их репрезентативности для всего препарата. Эти величины получают с помощью альтернатив­ной статистики, в которой используются показатели дисперсии, среднего квадратического отклонения и ошибки долевой части данной структурной составляющей в образце (т. е. вероятности положительного исхода, при котором точки приходятся на дан­ную структуру).

Необходимое для получения достоверных данных число то­чек (Р) можно не только установить по формуле (92), но и найти, используя график [Weibel Е., 1963]. После подсчета 100 точек число точек, пришедшихся на исследуемую структуру, относят к 100. Соответственно значению этого отно­шения от оси ординат восстанавливают перпендикуляр до пере­сечения с кривой. От точки пересечения опускают второй пер­пендикуляр к оси абсцисс графика, на которой и получают чис­ло подсчетов точек, необходимое для проведения исследования.

Например, при предварительном подсчете точек с целью оп­ределения объемной доли на корковое вещество среза почки собаки пришлось 14 точек, что составляет на 100 точек 14: 100 = 0,14. Найдя на оси ординат графика соответствующую точку, проведем все указанные выше манипуляции. Тогда най­дем, что для получения достоверных статистик, характеризующих удельный объем (W) и коркового вещества почки, необхо­димо подсчитать не менее 500 точек.

Различия в удельных объемах (площадях или длинах) для различных структурных составляющих одной точки или одной структурной составляющей для разных тканей оценивают со­гласно формуле (82), только значения М\ и М₂ представляются как V^іу и V²_v. Межгрупповые статистики оцениваются так же, как и при проведении вариационно-статистического исследова­ния.

Другой пример: при исследовании среза колонбиоптата, ок­рашенного гематоксилином и эозином, методом полей опреде­лили объемную долю инфильтрата собственной пластинки тол­стой кишки. При большом увеличении светового микроскопа перемещали квадрат сетки Автандилова, имеющий 100 точек, 10 раз по изображению собственной пластинки (всего 1000 тест-точек). С лимфоцитами совпало 120 точек, с плазмоцитами — 92, что составляет от 1000 точек соответственно долю 0,12 и 0,092, в сумме 0,212. Ошибки выборки получают по формулам для вычисления ошибок для случайных событий.

Значительно упрощается определение и ядерно-цитоплазматических отношений при применении иммерсии или тест-системы с большим числом точек. Подсчитав количество точек, приходя­щихся на ядро, а затем на цитоплазму, и взяв их отношение, получают соответствующий индекс для каждой клетки.

Для определения существенности различий в структурной организации различных тканей, или тканей одного типа при па­тологических изменениях на основе как количественной инфор­мации, так и установления качественных оценок могут быть использованы непараметрические критерии статистики.

Приведем описание применения парного критерия Вилкоксона (Т) и критерия знаков (КЗ), а также покажем особенно­сти их применения при решении задач морфометрического по­рядка. Остальные критерии следует использовать на основе ана­логичных подходов, а их детальное описание можно найти в со­ответствующих руководствах [Гублер Е. В., Генкин А. А., 1973; Автандилов Г. Г., 1980; Автандилов Г. Г. и др., 1981]. Критерий знаков и парный критерий Вилкоксона используют в случае сравнения связанных (парных) выборок, а критерий Вилкоксона — Манна — Уитни (критерий U) применим при сравнении независимых выборочных совокупностей.

Рассмотрим способы сравнения связанных выборочных сово­купностей. Если число пар наблюдений небольшое (не бо­лее 20), то применяют парный критерий Вилкоксона, если объ­ем выборочных парных совокупностей больше, то прибегают к критерию знаков как к более простому.

Например, при патологическом процессе в одной группе пре­паратов были установлены изменения, а в другой группе таких изменений найти не удалось. Требуется определить, достоверны или случайны изменения в первой группе препаратов.

Проведем анализ с использованием парного критерия Вил­коксона. Для этих целей найдем разности между данными свя­занными парами наблюдений и пронумеруем их числами нату­рального ряда в возрастающей последовательности как 1, 2, 3... согласно абсолютным значениям разностей, взятым по модулю, т. е. без учета их знака (+ или —). Если окажется, что не­которые разности имеют одинаковый модуль, то им приписы­вают номера, равные их средним порядковым значениям (на­пример, если на 3 одинаковые разности приходятся числа 4, 5, 6, то все они получают один и тот же ранговый номер, а именно 4+5+6=15:3 = 5). После этого находят сумму ранговых номе­ров для разностей с отрицательным знаком, ее принимают за экспериментальную оценку Т, которую необходимо поставить в соответствии с Т табличным. В табли­це приведены те максимально допустимые значения чисел раз­ностей с отрицательным знаком, при которых различия в вы­борках можно считать существенными.

Если число пар наблюдений превышает 20, то критерий Вил­коксона становится громоздким и отдают предпочтение «крите­рию знаков». Суть его состоит в следующем. В таблице для числа исходов с установленными изменениями находят то воз­можное число исходов, при котором изменения еще можно счи­тать существенными. Если полученное в опыте число исходов отрицательного значения меньше табличного, то выявленные изменения считают характерными для данного патологического процесса.

Например, при изучении патологического процесса в 110 пре­паратах из 360 были установлены изменения определенного типа. Следует определить, действительно ли они характерны для изучаемого явления.

Согласно той же таблице считаем, что для принятия сужде­ния о представительности установленных изменений изучаемому явлению необходимо и достаточно, чтобы число препаратов, в которых таких изменений не оказалось, не превышало 155. Так как в нашем случае оно равно 360—110 = 250 и превышает табличные значения, приходим к выводу, что установленные в препаратах изменения не типичны для изучаемого процесса.

Критерий Вилкоксона—Манна—Уитни (критерий U), как отмечалось выше, используют для сравнения независимых вы­борочных совокупностей. При числе наблюдений до 60 исполь­зуют специальные таблицы [Гублер Е. В., Генкин А. А., 1973; Гублер Е. В., 1978; Автандилов Г. Г. и др., 1981, 1987].

Метод состоит в следующем. Два ряда наблюдений группи­руют в возрастающей последовательности в виде одного так называемого упорядоченного ряда.

Если два числа оказываются одинаковыми, то каждое из них ставят на первое или второе место с помощью таблиц случай­ных чисел. Приписывают каждому из них соответствующий номер, и то число, номер которого в таблице случайных чисел окажется первым, записывают первым. Если число одинаковых пар равное, то число располагают так, чтобы не отдать пред­почтения ни одному ряду. После этого подсчитывают число ин­версий, т. е. сколько раз в упорядоченном ряду цифры первого и второго ряда меняются местами. За одну инверсию принима­ют такое расположение чисел, при котором перед каким-либо числом первого ряда в упорядоченном ряду находится одно чис­ло из второго ряда. Если перед ним стоят два числа второго ряда, то соответственно считают, что имеются две инверсии, и т. д. Число инверсий обозначают буквой U, откуда и следует название критерия. Для определения достоверности различий между двумя выборками (двумя рядами в упорядоченном ряду) подсчитывают общее число инверсий. После этого по таблице для числа наблюдений в первой и второй выборках находят то максимальное теоретическое значение С/_теор, при котором разли­чия еще можно считать существенными. Если полученное в опы­те число инверсий не превышает допустимого (табличного), то различия в выборках считают существенными.